摘要：目的 探索牛肉鹵煮加工過程中添加香蘭素和維生素C對雜環(huán)胺形成含量的影響。方法 采用固相萃取前處理技術，結合不同處理情況下高效液相紫外和熒光檢測法測定肉樣中雜環(huán)胺的含量。結果 香蘭素和維生素C都能夠減少鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的形成。當維生素C的添加濃度量達0.15%時, 雜環(huán)胺總量減少90%以上。當維生素C濃度增大到0.5mg/mL時, 維生素C對1,1-二苯基-2-三硝基苯(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除率高達90%；當維生素C添加濃度為0.4 mg/mL時, 其對超氧陰離子的清除率高達84%左右。結論 維生素C和香蘭素均可減少鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的生成, 維生素C對DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率均比香蘭素高, 且對鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的抑制效果比香蘭素好。

　　關鍵詞：香蘭素；維生素C；鹵煮牛肉；雜環(huán)胺

　　鹵煮是中國肉制品傳統(tǒng)加工方法之一, 因其能使肉制品具有松軟的質感和醇香敦厚的香氣所以深受大眾的喜愛并一直沿用至今。但肉制品含有豐富的蛋白質, 在鹵煮過程中易發(fā)生美拉德反應生成一類具有致癌作用的有機物——雜環(huán)胺。據流行病學研究報告顯示, 胃腸道疾病和多種腫瘤的發(fā)生與食品中的雜環(huán)胺有著密切的關系。迄今為止人類已經在食用肉制品中發(fā)現了30多種雜環(huán)胺的存在。這30多種雜環(huán)胺可分為氨基咪唑氮芳香烴和氨基咔啉嵋2大類,其化學結構和產生機制也有所不同。氨基咪唑氮芳香烴是由肌酸/肌酐、氨基酸和還原糖在300℃以下縮合聚合形成的；而氨基咔啉嵋是氨基酸和蛋白質300℃以上的高溫條件下熱裂解產生的。

　　近30年來, 國內外對于食品中雜環(huán)胺的分離檢測、安全評價、及產生機制等方面做了較為深入的研究。隨著人們對于健康飲食的追求, 如何有效抑制加工肉制品中雜環(huán)胺的生成成為當前研究的熱點。有研究表明自由基反應參與了雜環(huán)胺的生成, 而抗氧化劑或者含抗氧化成分的植物提取物能夠清除美拉德反應中產生的吡啶和吡嗪等自由基, 從而抑制雜環(huán)胺的生成。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率常被用來評價人工合成或天然抗氧化劑以及一些植物提取物抗氧化性的強弱。抗氧化劑的DPPH 自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率越大,說明其對美拉德反應中間產物的不穩(wěn)定自由基清除能力就越強。

　　楊瀟等在早期開展煙熏液替代傳統(tǒng)煙熏加工技術研究中, 發(fā)現煙熏液及其重要組成成分具有抑制雜環(huán)胺等多種化合物的作用，這可能與煙熏液中的抗氧化成分有關。Wong等在考察B族維生素對煎炸牛肉中2中雜環(huán)胺(PhIp、MeIQx)含量變化的影響時發(fā)現VB2、VB3、VB5、VB9、VB12對這2種雜環(huán)胺的抑制效果超過40%。Cheng等在研究12種酚類化合物對牛肉中雜環(huán)胺含量的影響時發(fā)現：柚皮素、槲皮素等黃酮類化合物能夠與雜環(huán)胺生成中間產物苯乙醛結合生成特定的化合物從而阻斷了雜環(huán)胺的形成。合理地添加一些人工合成或者天然抗氧化劑可以有效抑制加工肉制品中雜環(huán)胺的生成，但是人工合成的抗氧化劑如丁基羥基茴香醚和二丁基羥基甲苯等具有一定的潛在毒性, 所以用天然抗氧化劑代替人工合成抗氧化劑是個理想的選擇。目前二丁基羥基甲苯、白藜蘆醇、維生素E、十字花科植物中的異硫氰酸鹽和蔥蒜中的二丙烯基二硫化物已被證明可以抑制雜環(huán)胺的形成, 但其結果經常存在分歧。關于香蘭素和維生素C對肉制品鹵煮過程中雜環(huán)胺的影響尚未見相關報道。

　　本文以牛肉為研究對象，分別添加質量分數為0.05%、0.10%、0.15%的香蘭素和維生素C，研究鹵煮條件下不同添加濃度對雜環(huán)胺含量的影響, 并探究不同的添加物對DPPH的清除率和超氧陰離子的清除率的影響。

　　新鮮牛后腿肉、金龍魚調和油、中鹽特制低鈉食鹽、甘汁園雙碳綿白糖、海天醬油、海天生抽。

　　濃鹽酸、氫氧化鈉、三氯乙酸、冰醋酸、氨水、二氯甲烷；乙腈、甲醇；香蘭素、抗壞血酸。

　　雜環(huán)胺標品: 2-氨基-1-甲基-6-苯基-咪唑并[4,5-b]吡啶(2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine, PHIP)(CAS: 92180-79-5, 分子量: 227.27)；3-氨基-1-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(3-amino-1-methyl-5H-pyrido[4,3-b]indole,Trp-P-2)(CAS：72254-58-1，分子量: 257.29)；2-氨基-3,4,8-三甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹喔啉(2-amino-3,4,8-trimethyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline, 4,8-DimeIQX)(CAS: 95896-78-9, 分子量：227.27); 3-氨基-1,4-甲基-5H-吡啶并[4,3-b]吲哚(3-amino-1,4-dimethyl-5H-pyrido[4,3-b]indole，Trp-P-1)(CAS：62450-06-0, 分子量: 211.26)；2-氨基-3,4-二甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹喔啉(2-amino-3,4-dimethyl-3H-imidazo [4,5-f]quinoxaline, MeIQ)(CAS: 77094-11-2，分子量: 212.25);2- 氨基-3,8- 二甲基吲哚并[4,5-f] 喹喔啉(2-amino-3,8-dimethylimidazo[4,5-f]quinoxaline, MeIQX)(CAS：77500-04-0,分子量: 213.24)；1- 甲基-9H- 吡啶并[3,4-b] 吲哚(1-methy-9H-pyrido[3,4-b]indole, Harman)(CAS: 244-63-3，分子量: 168.19)；2- 氨基-9H- 吡啶并[3,4-b] 吲哚(2-amino-9H-pyrido[2,3-b]indole, AαC)(CAS: 26148-68-5,分子量：183.21)；2-氨基-3-甲基-3H-咪唑并[4,5-f]喹喔啉(2-amino-3-methyl-3H-imidazo[4,5-f]quinoxaline, IQ)(CAS:108354-47-8, 分子量：199.21)。以上標準品純度均大于99%。

　　G1315A紫外檢測器、G1312熒光檢測器、Agilent1100高效液相色譜儀、硅藻土Bond Elut-PRS柱(500mg/3mL)、Bond Elut-C18柱(500mg/3mL)；AR1140電子分析天平；BCD-249CF美菱冰箱；DGF30/7-Ⅰ型電熱鼓風干燥箱；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式多用真空泵；CR15RT型臺式高速冷凍離心機；T 6紫外分光廣度計；ASE-12固體萃取儀；HH-2型數顯恒溫水浴鍋；GW-4高溫烘箱；ZSBN-3004全自動不銹鋼雙切機。

　　首先剔除原料牛肉中脂肪和筋膜, 然后用雙切機制成5mm×1cm×5cm大小的肉條, 并分裝成50g每份置于冰箱中備用。

　　鹵煮：取白砂糖1g、食鹽1g、醬油5mL、蒸餾水150mL 置于250mL帶有刻度的加蓋搪瓷缸中配成鹵液并加熱至沸騰(沸騰狀態(tài)下鹵液溫度為98℃左右)。然后取肉條100g放入鹵液中加蓋, 在電磁爐上用小火慢燉, 進行鹵制2 h，每隔30min補充1次開水(蒸餾水)至原刻度，保證最終鹵液體積于起始相同。將處理后樣品冷卻至室溫，后于-18℃下冷凍、備用。

　　實驗組：維生素C 添加組: 取白砂糖1g、食鹽1 g、醬油5mL、蒸餾水150mL 置于250mL的搪瓷缸中配成鹵液并加熱至沸騰(沸騰狀態(tài)下鹵液溫度為98℃左右)。然后取50g分別添加了0.025g(0.05%)、0.05 g(0.1%)、0.075g(0.15%)維生素C的肉條置于沸騰的鹵液中，加蓋在電磁爐上用小火慢燉，進行鹵制2h，每隔30min補充1次開水(蒸餾水)至原刻度，保證最終鹵液體積與起始相同。

　　香蘭素添加組：取白砂糖1g、食鹽1g、醬油5mL、蒸餾水150mL 置于250mL的搪瓷缸中配成鹵液并加熱至沸騰(沸騰狀態(tài)下鹵液溫度為98℃左右)。然后取50 g 分別添加了0.025g(0.05%)、0.05g(0.1%)、0.075g(0.15%)香蘭素的肉條置于沸騰的鹵液中，加蓋在電磁爐上用小火慢燉，進行鹵制2h，每隔30 min補充1次開水(蒸餾水)至原刻度，保證最終鹵液體積與起始相同。

　　對照組：取白砂糖1g、食鹽1g、醬油5mL、蒸餾水150mL置于250mL的搪瓷缸中配成鹵液并加熱至沸騰(沸騰狀態(tài)下鹵液溫度為98℃左右)。取50g的肉條置于沸騰的鹵液中，加蓋在電磁爐上用小火慢燉，進行鹵制2h，每隔30min補充一次開水(蒸餾水)至原刻度，保證最終鹵液體積與起始相同。

　　空白組：取白砂糖1g、食鹽1g、醬油5mL、蒸餾水150mL置于250mL的搪瓷缸中配成鹵液但不加熱。取50g的肉條置于鹵液中，保持2h。

　　2.4.1  標準曲線的制作

　　準確稱取9種單個雜環(huán)胺標準品各1mg分別溶于10mL甲醇溶液中得到100μg/mL的雜環(huán)胺標準液，依次將雜環(huán)胺標準品稀釋到1、5、10、50、100ng/mL，并據此建立標準曲線。

　　2.4.2  雜環(huán)胺的提取

　　取2g處理好樣品于50mL離心管中, 加入12 mL 2mol/L的NaOH溶液并均質處理成漿狀，接著在4℃、10000r/min條件下冷凍離心20min。將上清液倒入事先稱好含有10g硅藻土的燒杯中，攪拌均勻后加入初次洗脫管中洗脫，初次洗脫管和丙基磺酸(propyl sulfonic acid,PRS)陽離子交換柱用連接閥連接起來, PRS柱使用之前要用5mL的二氯甲烷進行活化處理。連接好固相萃取裝置, 打開真空泵, 緩慢加入70mL二氯甲烷，以2滴/3s的速度洗脫。

　　2.4.3  高效液相色譜條件

　　極性雜環(huán)胺(MeIQX、MeIQ、IQ、DimeIQX)通過紫外檢測器進行檢測，檢測波長為63 nm；非極性雜環(huán)胺(Trp-P-2、Harman、Trp-P-1、AαC)和極性雜環(huán)胺PHIP通過熒光檢測器檢測, 檢測時激發(fā)光波長為300nm，散色光波長為440nm。

　　色譜柱為TSK-Gel ODS-80TM(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫設定在30℃；采用雙流動相，流動相A：乙腈；流動相B: 0.05 mol/L 醋酸-醋酸氨緩沖液(pH=3.6)，流動相梯度洗脫順序如表1所示。

表1  流動相梯度洗脫順序

　　準確稱取1.972mg DPPH用乙醇溶液并定容與10mL容量瓶中, DPPH濃度為0.5 mmol/L, 避光保存(0～4℃)；向4 mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液中加入4 mL不同質量濃度(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)的香蘭素和維生素C溶液，混勻，暗處放置1h，在515nm波長處測定吸光度Ai。以4mL蒸餾水作空白對照，515nm波長處測定吸光度A0，以4mL蒸餾水加4mL不同濃度的樣液515nm波長處測定吸光度Aj，重復3次。按下面公式計算DPPH自由基清除率。
      

　　取3mL 0.05mol/L Tris-HCl 緩沖液(pH=8.2)，置于25℃水浴20min，分別加入同體積不同濃度的待測液(這里將待測液依次稀釋至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL)，和0.6mL30mmol/L鄰苯三酚溶液, 混勻后于25℃水浴25min，加入0.5mol/L 1 mol/L HCl終止反應，于325 nm 處測吸光度A1；若考慮樣品自身在325 nm處的吸光值，記吸光度為A2。空白對照組為A3。則
      

　　以上實驗均重復3次, 取平均值。

　　9種雜環(huán)胺的線性方程、相關系數、線性范圍和檢出限見表2。結果表明此方法適用于9種雜環(huán)胺的檢測。

　　不同濃度不同添加物對牛肉極性和非極性雜環(huán)胺含量的影響見表3、表4，添加物對雜環(huán)胺總量的影響見圖1。結果表明：香蘭素和維生素C的添加均可使鹵煮牛肉中的雜環(huán)胺總量顯著降低(P＜0.05)。從上述表格數據可以看出,添加維生素C時牛肉中的極性和非極性雜環(huán)胺含量均減少。而香蘭素隨著濃度增大，極性雜環(huán)胺反而有所增高，可見香蘭素只能降低非極性雜環(huán)胺的水平。當維生素C的添加濃度量達0.15%時，雜環(huán)胺總量減少99%。綜上所述，維生素C較香蘭素相比能夠更好地減少鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的生成。

 

表2  9種雜環(huán)胺的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限

　　注: Y為峰面積；X 為質量濃度，ng/mL。

表3  不同濃度不同添加物對牛肉極性雜環(huán)胺含量的影響(ng/g, n=3)

　　注: ND表示該物質未檢出；同一列不同字母表示差異性顯著(P﹤0.05)。

 

表4  不同濃度不同添加物對牛肉非極性雜環(huán)胺含量的影響(ng/g, n=3)

　　注: ND表示該物質未檢出；同一列不同字母表示差異性顯著(P﹤0.05)。

圖1  添加物對雜環(huán)胺總量的影響(n=3)

　　本實驗過程中采用的DPPH濃度是0.8 mg/mL, 設置的外源添加物的濃度分別是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL。從圖2中可以看出DPPH自由基清除率總體隨著添加物濃度的增加是呈明顯上升趨勢(P＜0.05), 且維生素C的DPPH自由基清除效果明顯比香蘭素好，當濃度增大到0.5mg/mL時，DPPH自由基清除率高達90%左右，而香蘭素的DPPH自由基清除率卻只有30%左右。綜上所述：維生素C較香蘭素相比具有更好的DPPH自由基清除能力，同時也說明了抗氧化性與其對牛肉制品雜環(huán)胺形成的抑制具有一定的相關性。

圖2  DPPH清除率的測定(n=3)

　　超氧陰離子清除率見圖3, 結果顯示，香蘭素和維生素C均有清除超氧陰離子自由基的能力, 并且其對超氧陰離子清除率總體隨著濃度增大呈明顯上升趨勢(P＜0.05)。但是當維生素C的濃度高于0.4mg/mL時, 超氧陰離子清除率反而有所下降。當維生素C添加濃度為0.4mg/mL時,清除率達到最高，高達84%左右，而香蘭素對超氧陰離子自由基的清除率最高只有40%左右，明顯低于維生素C。綜上所述：維生素C的超氧陰離子清除率明顯高于香蘭素，這也剛好說明抗氧化性與其對牛肉制品雜環(huán)胺形成的抑制具有一定的相關性。

圖3  超氧陰離子清除率的測定(n=3)

　　香蘭素和維生素C都能夠減少牛肉鹵煮過程中雜環(huán)胺的形成，并且隨著香蘭素和維生素C的添加量的增加,雜環(huán)胺的總量呈明顯降低趨勢(P＜0.05)，當維生素C的添加濃度量達0.15%時，雜環(huán)胺總量減少90%以上。維生素C對DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除效果均比香蘭素好；當濃度增大到0.5mg/mL時，維生素C對DPPH自由基清除率高達90%，而香蘭素的DPPH 自由基清除率卻只有30%左右；當維生素C添加濃度為0.4 mg/mL時，其對超氧陰離子的清除率達到最高，高達84%左右，而香蘭素對超氧陰離子自由基的清除率最高只達40%左右。所以維生素C和香蘭素均可減少鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的生成，而且維生素C對DPPH自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率均比香蘭素高，且對鹵煮牛肉中雜環(huán)胺的抑制效果比香蘭素好，這可能與其抗氧化性的強弱有關。